استخراج DNA
اساس تمام تحقیقات بیوتکنولوژی، دستکاری DNA و آنالیز آن است. پیش از تمامی تکنیک‌ها، به عنوان مثال به منظور تهیه DNA نوترکیب و تست‌های تشخیصی، محققان نیازمند متدهایی به منظور استخراج DNA از ارگانیسم‌های مختلف و خالص‌سازی آن تا حد معینی هستند. تکنیک‌هایی که برای استخراج DNA استفاده می‌شوند، بسته به منبع نمونه، اندازه و قدمت آن متفاوتند.
با توجه به تنوع فراوان این روش‌ها، اشتراکاتی هم مابین آن‌ها وجود دارد. آن جدا کردن DNA از سایر اجزای سلولی است. این DNA می‌تواند DNA کروموزومی، پلاسمید و یا باکتریوفاژ باشد. می‌تواند از تمام نمونه‌های بیولوژیکی مانند بافت‌های زنده و فیکس‌شده، سلول‌ها و … استخراج شود. استخراج DNA باید به ملایم‌ترین شیوه ممکن لیز بافت صورت بگیرد. تا از آسیب به DNA و شکستن آن به قطعات کوچکتر جلوگیری شود.
استخراج DNA برای اولین بار در سال ۱۸۶۹توسط فردریش میشر، پزشک سوئیسی، انجام گرفت. وی تلاش کرد که به منظور آزمایشات خود، سلول‌ها را از گره‌های لنفاوی استخراج کند. اما تامین غلظت مناسبی از لنفوسیت‌ها بسیار دشوار و حتی غیرممکن بود. در نتیجه، سلول مورد نظر او به لوکوسیت‌ها تغییر یافت که از چرک تجمع یافته در پانسمان‌های جراحی به دست می آمدند. در ابتدا، تمرکز میشر روی انواع گوناگون پروتئین‌هایی بود که لوکوسیت‌ها را تشکیل می‌دهند. او توانست نشان دهد که پروتئین‌ها ماده اصلی تشکیل‌دهنده سیتوپلاسم سلول می‌باشند. در حین این آزمایشات، وی متوجه شد که در صورت افزودن اسید به محلول، ماده‌ای ته‌نشین شده و با افزودن باز دوباره حل می‌گردد. به این ترتیب برای نخستین بار، رسوب ناخالصی از DNA به دست آمد.
جدا کردن DNA
فردریش میشر به منظور جدا کردن DNA از پروتئین موجود در عصاره‌های سلولی، پروتکلی جدید طراحی کرد. این پروتکل به منظور جدا کردن هسته از سیتوپلاسم طراحی کرد. سپس DNA را استخراج نمود. نخستین پروتکل نتوانست به توید میزان محصول کافی منجر شود. نیاز به پروتکلی دومی بود که نوکلئین خالص شده بیشتری را تهیه کند. نوکلئین، بعدها توسط ریچارد آلت من نوکلئیک اسید نام گرفت.
پس از میشر تلاش‌های دیگری نیز به این منظور صورت گرفت و باعث پیشرفت‌های فراوان دیگری در فرایند استخراج DNA شد. اولین پروسه های آزمایشگاهی روتین برای استخراج DNA، بر پایه استراتژی‌های سانتریفیوژ بر اساس چگالی توسعه یافتند. Meselson و Stahl در سال ۱۹۵۸ از این متد برای توضیح همانندسازی نیمه حفاظت شده DNA استفاده کردند. پروسه‌های بعدی از تفاوتهای موجود در حلالیت DNAهای بزرگ کروموزومی، پلاسمیدها و پروتئین‌ها در بافر قلیایی بهره بردند. هم اکنون متدهای اختصاصی فراوانی برای استخراج DNA خالص ایجاد شده‌اند. متدها اکثرا به صورت کیت‌های تجاری موجودند.
آنالیز ژنتیکی
استخراج DNA برای آنالیز ژنتیکی آن به منظور اهداف علمی، پزشکی و جنایی، ضروری است. دانشمندان از DNA استخراج شده در مواردی همچون وارد کردن DNA بیگانه به درون سلول‌ها و یا در تشخیص استفاده می‌کنند. در پزشکی این کار ارزش تشخیصی دارد. در امور جنایی از DNA استخراج شده در تعیین هویت افراد استفاده میشود. منابع DNA مورد استفاده بسیار متنوع بوده و می‌تواند از هر ارگانیسم زنده و غیرزنده‌ای به دست آید. منابع معمول عبارتند از خون کامل، مو، اسپرم، استخوان‌ها، ناخن‌ها، بزاق، سلول‌های اپی‌تلیال، ادرار، باکتری‌ها و… .
بنابراین واضح است که هر کدام از روشهای استخراج DNA باید مطابق با نمونه مورد نظر باشند. به نحوی که بتوان با استفاده از آن‌ها به طور موثری DNA را از نمونه مورد نظر جداسازی نمود. مسئله بعدی اندازه نمونه است. به عنوان مثال روش استخراج از یک نمونه کوچک مانند اسپرم یا یک تار مو با روش مورد استفاده در مورد چند میلی‌لیتر خون متفاوت است. فاکتور مهم دیگر، طول عمر نمونه است. نمونه ممکن است تازه و یا ذخیره شده باشد. نمونه‌های ذخیره شده ممکن است از خون و یا بافت منجمد شده، استخوان و یا نمونه‌های باستانی انسانها، حیوانات و گیاهان به دست آیند.
آسان‌ترین فرایند استخراج، استخراج DNA از باکتری‌هاست؛ چون سلول‌های باکتریایی دارای ترکیبات ساختاری فراوانی زیر دیواره سلولی و غشای خود نیستند. باکتری‌هایی مانند E. coli، از آن جایی که فرایند استخراج DNA آسان‌تری دارند، ارگانیسم انتخابی به منظور دستکاری تمام انواع ژن‌ها می‌باشند. در E. coli ، هر دو نوع DNA ژنومی و پلاسمید موجود است و نحوه افتراق آن‌ها از همدیگر، طول بسیار بلندتر DNA ژنومی است.
تخریب سلول
معمولا استخراج DNA با لیز یا از هم گسستن بافت و سلول‌ها آغاز میشود. به این منظور غشای سلولی باید تخریب گردد. این فرایند برای تخریب ساختارهای پروتئینی و نیز آزاد کردن اسیدنوکلئیک از هسته ضروری است. در حالت کلی، لیز نمونه در محلول نمکی حاوی دترجنت‌ها و پروتئازها مانند Proteinase K انجام گرفته. این کار موجب از هم گسستن ساختارهای سلولی و حل شدن غشا میشود. در باکتری‌ها، آنزیمی به نام لیزوزوم، پپتیدوگلیکان‌ها را که ترکیب اصلی دیواره سلولی هستند، هضم می‌کند. سپس شوینده‌ای (detergent) مانند سدیم دودسیل سولفات (SDS) با بر هم زدن ساختار لیپیدی دو لایه، غشا را تخریب می‌نماید.
در استخراج DNA در مورد سایر ارگانیسم‌ها نحوه تخریب سلول بستگی به ساختارشان دارد. نمونه‌های بافتی از جانوران و گیاهان باید به قطعات کوچکتری تقسیم شوند. تا ترکیبات داخل سلولی شان آزاد گردد. سلول‌های گیاهی باید ابتدا در مخلوط‌کن کاملا تکه‌تکه شوند. باعث میشود دیواره‌های سلولی سخت شکسته شوند. سپس بافت دیواره به کمک آنزیمها هضم می‌گردد. بعد پلیمرهای بلند لیگنین و سلولز به صورت مونومر دربیایند.
DNA موجود در بافت‌های جانوری مانند نوک دم موش، پس از تجزیه بافت توسط پروتئیناز K و حل شدن غشا توسط شوینده‌ها صورت می‌گیرد. سلول‌های کشت‌شده آسان‌ترین سلول‌ها به منظور استخراج DNA هستند. چون دارای دیواره سلولی و ساختارهای دیگری در خارج از غشای سلولی خود نمی‌باشند. کاری که شوینده انجام می‌دهد، تنها تخریب غشا به منظور آزادسازی ترکیبات داخل سلولی است. هر ارگانیسم و بافتی نیازمند ایجاد یک سری تغییرات جزئی در فرایند به منظور آزادسازی ترکیبات داخل سلولی مانند DNA می‌باشد.
لیز سلول
لیز سلول‌ها و بافت‌های نرم در استخراج DNA آسان است. اما گاهی نیاز داریم که این کار را در مورد بافت‌های سختی مانند استخوان، چوب نیز انجام دهیم. بسیاری از نمونه‌های گیاهی چوبی در نیتروژن مایع منجمد شده و بلافاصله به صورت پودر خرد می‌شوند. استخوان‌ها حاوی مواد معدنی فراوانی هستند و باید پیش از استخراج یون‌ها از آن برداشته شوند تا بعدا در فرایندهایی مانند PCR اختلال ایجاد نکنند. پس از آنکه این پردازش‌ها روی نمونه انجام گرفت، باید هموژنیزاسیون توسط دستگاه‌های لازم انجام گیرد تا مخلوط یکنواخت شده. سپس عمل لیز کردن انجام شود.
بعد از آزاد شدن ترکیبات داخل سلولی، باید آن‌ها را از بقایای غشای سلولی، استخوان، غضروف، دیواره سلولی و … و توسط سانتریفیوژ و یا به طریق استخراج شیمیایی جدا نمود. سانترفیوژ کردن باعث جدایی ذرات بر اساس اندازه‌شان میشود، چون مولکول‌های بزرگتر و سنگین‌تر زودتر از مولکول‌های کوچکتر ته نشین می‌شوند. به علاوه موادی که در فاز آبی نامحلول هستند، لخته‌هایی را تشکیل می‌دهند که سریع‌تر در کف لوله سانتریفیوژ ته‌نشین می‌گردند. به عنوان مثال، پس از تخریب دیواره سلولی، قطعات حاصل از آن کوچکتر از مولکول‌های DNA می‌گردند. سانتریفیوژ باعث میشود که مولکول‌های DNA به صورت یک توده در آمده و قطعات محلول دیواره سلولی در لوله باقی بمانند.
جدا کردن قطعات سلولی
متد دیگری که به منظور جدا کردن قطعات سلولی استفاده میشود، استخراج شیمیایی با استفاده از فنول است. این روش به منظور جداسازی پروتئین‌های ناخواسته از DNA است. فنول اسیدی است که می‌تواند ۶۰ تا ۷۰ درصد مولکول‌های زیستی از جمله پروتئین‌ها را از بین ببرد. فنول چندان در آب محلول نیست و پس از مخلوط شدن با نمونه آبی حاوی DNA و پروتئین، دو فاز مخلوط از یکدیگر جدا می‌شوند. پروتئین در لایه فنولی و نوکلئیک‌اسید در لایه آبی قرار می‌گیرد. دو لایه توسط سانتریفیوژ از یکدیگر جدا می‌شوند و به این ترتیب DNA موجود در لایه آبی از فنول جدا می‌گردد.
بعد از جدا شدن مولکول‌های DNA از پروتئین‌ها، نمونه هنوز دارای هر دو نوع نوکلئیک‌اسید RNA و DNA است. از آن‌جایی که RNA نیز یک نوکلئیک اسید است، در فنول محلول نیست. آنزیمی به نام ریبونوکلئاز (RNase)، RNA را به ریبونوکلئوتیدها تبدیل می‌کند. در نتیجه این کار، تولید نمونه DNA ای است که در محلولی از قطعات RNA و ریبونوکلئوتیدها قرار دارد. در صورت افزودن حجم یکسانی از الکل، قطعه بسیار بزرگ DNA از فاز آبی جدا و توسط سانترفیوژ استخراج می‌گردد و ریبونوکلئوتیدها به صورت محلول باقی می‌مانند. DNA حاصل می‌تواند در آزمایشات مختلف استفاده شود
پلاسمید
در مهندسی ژنتیک معمولا سه نوع DNA استخراج میشود: کل DNAهای موجود در سلول (Total DNA)، DNA پلاسمید و DNA باکتریوفاژ. Total DNA اغلب به عنوان منبع تهیه ژن‌ها به منظور کلون کردن استفاده میشود و شامل DNA ژنومی ارگانیسم و سایر مولکول‌های DNA موجود در آن مانند پلاسمید است. روش استخراج DNA خالص پلاسمیدی، همانند total DNA است. با این تفاوت که در یکی از مراحل پلاسمید باید از سایر مولکول‌های DNA جدا شود.
DNA پلاسمیدها در فرایندهای بیولوژی مولکولی مدرن باکتریوفاژ غالبا زمانی استخراج میشود که به عنوان وکتور مورد نیاز باشد. DNA پلاسمیدها معمولا از ذرات ویروسی استخراج میشود، نه از سلول‌های باکتریایی آلوده به ویروس. البته استثنائاتی هم وجود دارد. در این حالت تکنیک‌های خاصی باید برای از میان بردن کپسید به کار رود.
دستگاه میکروفیوژ آزمایشگاهی (Micro fuge) یکی از تجهیزاتی است که در پروسه استخراج RNA و DNA کاربرد دارد. دستگاه میکروفیوژ یکی از محصولات شرکت نسل امید پژوهش می‌باشد.
استخراج DNA، استخراج دی ان ای، استخراج RNA